人活在世界上，基本上每天要做的有四件事：呼吸、睡眠、饮水和进食。《黄帝内经》中说：“躁则消亡，静则神藏”。睡眠，这个锚定在人类基因中的生理活动，占据了人类生命总长的三分之一。与睡眠相对应的一个词，失眠，现已成为当今社会的流行词。“失眠是一种病/视线模糊的眼睛/翻来覆去的地狱/谁带我逃离这里”。据流行病学近年统计，中国目前有超过三亿人具有睡眠障碍，成年人失眠发生率高达38.2%。美国有近7000万人受到失眠折磨，每年每四个人当中就有一个被诊断为失眠症，需要定期或长期服用镇静催眠药物。正因为有如此庞大的受众群体，镇静催眠药物的开发力度持久绵长。仅安定（Diazepam, 商用名Valium，苯二氮卓类）一种目前市场上就有超过500个品牌。因此对镇静催眠药物的机制研究和开发一直是科学界的研究热点。
McCarthy, K. (2017, August 28). Confessions Of An Insomniac. Retrieved from https://www.t heodysseyonline.com/self-diagnosed-insomniac .
GABAA受体（-氨基丁酸A型受体）是一种由五个亚基组成的配体门控离子通道受体。其内源性配体是一种被称为GABA（-氨基丁酸）的神经递质，GABA是脊椎动物中枢神经系统中的主要抑制性神经递质。GABAA受体的活性位点和异构调节位点是多种抗焦虑、失眠和麻醉药物，例如苯二氮卓类、巴比妥类、乙醇、神经災体以及吸入性麻醉剂等的作用靶点。GABAA受体与GABA结合后能够快速开放Cl-通道介导中枢神经系统快速抑制性突触传递。突触是指一个神经元的冲动传到另一个神经元或传到另一细胞间的相互接触的结构。突触上GABAA受体的数量、分布和动力学性质的改变是调节抑制性突触传递强度和神经环路信息处理的关键机制。而GABAA受体的相关功能的改变与调节（突触受体数量、分布和动力学性质的改变）到底是自发性的还是受到某些未知附着蛋白的调控还不得而知。而针对这些问题的研究对于理解中枢神经系统内突触抑制性调控和镇静催眠药物的作用机制是十分重要的。2019年10月11日，美国国立卫生研究院贝塞斯达总部陆伟团队在Science杂志上发表了题为Shisa7 is a GABAA receptor auxiliary subunit controlling Benzodiazepine actions的研究。这项工作首次发现一种单跨膜蛋白 (Single-pass transmembrane protein) Shisa7作为GABAA受体的辅助亚基能够调节GABAA受体的运输、功能和镇静催眠药物的药理作用。
“Han et al., investigated if a protein called Shisa7 was involved in regulating GABAA receptor expression and function…Shisa7 was found at GABA-releasing synapses, where it interacted with GABAA receptors, controlled receptor concentration at the synapse, sped up receptor expression, gating kinetics, and pharmacology of GABAA receptors in the brain.”
——Science, Peter Stern (Senior editor)
随着蛋白质组学的发展，研究人员对GABAA受体关联蛋白尤其是突触相关蛋白之间的功能相关性研究越来越感兴趣。通过对AMPA受体（离子型谷氨酸受体，与GABAA受体功能相反，介导快速兴奋性突触传递）辅助亚基（Auxiliary subunit）的系统性研究之后，确定了辅助亚基的存在价值和重要意义。因此也总结出离子型通道受体的辅助亚基的功能特点：1）在细胞表面可以与离子型受体形成稳定的复合物；2）能够调节离子型受体的功能（突触后电流以及动力学性质等功能）；3）调节离子型受体在细胞表面的运输等【1】。近几年来，几个实验团队分别针对跨膜蛋白LHFPL4/GARLH4【2-4】和Clptm1【5】发表了关于这两种蛋白对GABAA受体调节的研究论文。这些文章打破了一直以来人们对GABAA受体的认知局限，阐述了这两种新跨膜蛋白对GABAA受体的调节作用。但遗憾的是，人们未能发现这两种蛋白改变GABAA受体动力学性质，也没有发现这两种蛋白参与GABAA受体相关的药理作用，这意味着可能有其他跨膜蛋白与GABAA受体形成复合体并能够调节GABAA受体动力学性质。
2004年，日本学者首次发现能够调节蛙类头部形成的基因，并以日本南部神话雕像命名该基因为Shisa，意为守护者。Kanpai. (2015, November 30). Shisa: The Guardian Lions of Okinawa. Retrieved from https://www.kanpai-japan.com/lifestyle/shisa-okinawa .
Shisa7是一种单跨膜蛋白，属于Shisa家族，该蛋白家族结构特点是都具有胞外区域富含胱氨酸重复结构 (cystine-rich repeat region) 以及胞内尾端的盘状同源区域配体（PDZ motif）。在本文中，研究者通过对Shisa7在抑制性突触后共定位、GABAA受体相关电生理性质和动力学性质的调节作用以及对GABAA受体细胞表面的运输等研究首次发现Shisa7是一种GABAA受体的辅助亚基，并且Shisa7的缺失能够显著降低Diazepam的镇静,抗焦虑和催眠等的药理作用。前期研究表明，Shisa蛋白家族与中枢神经系统内另外一种重要的离子通道受体AMPA受体具有相关性【6】。与GABAA受体功能相反，AMPA受体能够介导哺乳动物中枢神经系统快速兴奋性突触传递。已有文章显示该家族成员Shisa6和Shisa9是AMPA受体的辅助亚基。有趣的是，在探索Shisa家族与AMPA受体相关性研究过程中，人们发现Shisa7作为该家族成员家族蛋白在异源细胞中并没有明显调节AMPA受体相关功能的作用【6】。我们因此提出一种可能性假设，Shisa7可能具有与其它家族成员不同的功能，其有可能参与非AMPA受体的功能性调控作用。为了验证该假设，陆伟团队的韩文妍博士与李军博士一起应用免疫细胞化学方法检测了Shisa家族蛋白在海马神经元中的亚细胞分布，并应用AiryScan超分辨率显微技术和STED（受激发射损耗荧光显微技术, 这是同Ling-Gang Wu团队的Lihao Ge博士的合作）证明了不同于其他Shisa家族蛋白（Shisa6和Shisa9）与兴奋性突触蛋白标志物共定位，内源性Shisa7蛋白主要与抑制性突触后蛋白标志物 (Gephyrin和vGAT) 以及GABAA受体亚基共定位。之后韩文妍博士进一步应用CRISPR-CAS9技术结合子宫内电穿孔技术 （In utero electroporation）在小鼠海马CA1区域椎体神经元内（pyramidal neuron）单细胞基因敲除Shisa7。单细胞敲除Shisa7导致在急性海马脑片内引起小抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic current, mIPSC）频率降低，而且这种现象在基因敲除小鼠身上也同样发生。在应用双全细胞膜片钳记录（dual whole-cell recording）中也发现，与对照组相比，单细胞基因敲除Shisa7能够显著降低急性海马脑片内刺激引发的抑制性突触后电流（evoked IPSC）说明Shisa7在保持抑制性突出后电流正常输出中具有重要作用。这些发现包括Shisa7存在于抑制性突触后并能够调节突触后电流的输出，促使研究者又通过使用共免疫沉淀法发现在异源细胞内Shisa7和单独GABAA受体1，2和2亚基具有相互作用。在小鼠脑海马组织内也发现了这些蛋白之间的相互作用。研究者还通过交互变异克隆手法确定了在Shisa7胞外N端存在一段不保守区域（N154-175-Shisa7）, 这段不保守区域被鉴定为Shisa7与GABAA受体的结合区域，命名为GRID (the GABAAR interacting domain) 。过表达的Shisa家族蛋白在海马神经元中的亚细胞分布
通过对Shisa7基因敲除小鼠海马组织突触体内GABAA受体相关蛋白表达的研究，研究者还发现敲除Shisa7能够显著引起突触体内多种GABAA受体亚基蛋白表达量下调。不仅如此，陆伟团队韩文妍博士和Jun Li博士以及NIH/NIDCD的Ronald S. Petralia博士和Ya-Xian Wang女士还利用蛋白免疫荧光染色法和免疫金电镜法考察了对照组和Shisa7基因敲除组突触内GABAA受体亚基蛋白表达水平。结果显示，Shisa7基因敲除组中突触体内GABAA受体亚基1和2蛋白表达水平显著降低，以上结果说明Shisa7参与调节GABAA受体在细胞表面的运输和调控抑制性突触传递强度。确定一个蛋白是否是离子型受体的辅助亚基的关键在于其是否对该离子型受体的脱敏和失活等动力学特性有影响。研究结果表明，Shisa7与GABAA受体形成复合物后能够改变GABAA受体的动力学特性，最终改变通过GABAA受体进入到细胞和突触的总电荷数。通过以上结果研究人员初步描绘了Shisa7作为GABAA受体辅助亚基的功能框架，发现原来GABAA受体并不是独立的存在，在它的周围结合着一些辅助蛋白能够帮助和平衡GABAA受体在细胞表面的正常表达和行使功能，并进而调控抑制性突触传递强度和神经环路信息处理等功能作用。那么到底Shisa7是否参与跟GABAA受体相关的药理作用呢？Wenyan Han博士通过应用GABA介导的全细胞电流膜片钳方法考察了一系列相关蛋白在Diazepam引起的电流增强作用中的作用。结果发现，在这些蛋白中（包括前文提到的LHFPL4/GARLH4），只有Shisa7能够改变Diazepam引起的电流增强作用。在这之后，Wei Lu团队进行了一系列Diazepam相关行为学实验，确定了在Shisa7敲除小鼠中Diazepam的镇静、抗焦虑和催眠等药理作用显著减弱。这些发现阐明了Shisa7作为GABAA受体辅助亚基参与镇静催眠药物的药理作用，为临床药物开发和基因治疗提供了重要的临床前数据。
在课题进行期间，我们面临的最大挑战和局限就是对内源跨膜蛋白的位置确定问题。由于跨膜蛋白的特殊性，导致一时之间无法从市面上购买到满意的抗体，即使自己做抗体也是成败几率对半。Shisa7就是一个很好的例子。我们首先针对Shisa7胞内一段结构设计了多克隆抗体，免疫印记活性虽然良好，但遗憾的是，由于Shisa7蛋白具有复杂的糖基化和其他未知的三维结构，导致该抗体非特异性条带较多且无法用于免疫荧光实验。之后我们又试图利用CRISPR-CAS9基因敲入技术在Shisa7的胞外起始端插入一个3xFlag标记物。标记物的插入虽然成功，但可能是由于Shisa7胞外结构的高度不稳定和不确定性引起了转基因小鼠的一系列原因不明的异常改变，例如杂合子雄性小鼠生殖器容易感染进而无法授精导致繁育率极低；转基因小鼠里的Shisa7蛋白表达只有野生型小鼠的一半并且带有标记物的Shisa7蛋白表达更低，这导致即使在纯合子的原代神经元内的荧光强度十分微弱，没办法清晰定位神经元内源Shisa7。折腾、彷徨和纠结了近1年左右，最终只有无奈接受转基因敲入小鼠的开发失败。但幸运的是，最后我们与GenScript生物公司合作开发了单克隆抗体，在经过筛选近100个单克隆抗体样本后，终于获得了一个能够应用于免疫荧光实验的单克隆抗体。在课题进行期间，得到实验室里分子神经生物学博士Jun Li的大力帮助，我们共同经历了很多实验瓶颈。在经过无数次的讨论我们最终解决了诸多免疫荧光技术上的难题。
在2017年圣诞节前，荷兰一课题组率先发表了一篇关于Shisa7和AMPA受体相关性的文章【7】，其观点结论与我们的初始观察到的实验现象有所不同。这对于当时还处于课题中期的我来说是一种意外也是一种挑战。在这之后，我虽然经常性失眠，以及压力性肥胖（嗯，我就是这么安慰自己的，并不是我吃得多……），但探索真相的原始驱动力促使我们不断完善实验思路和实验设计。可能压力就是动力，这篇文章一直鞭策我们多转换思考问题的角度，多验证数据的可靠性还有多获得不同的角度的具有关键意义的数据去完善和证明我们的观察和假说。经过团队3年的努力与坚持，在陆伟博士的鼓励下，我们将这项工作投到Science杂志。也许是被幸运之神眷顾，我们的工作得到全体审稿人的一致高度评价，最终从投稿到被Science杂志接受只用了4个半月的时间。
我是Jun Li，很高兴亲身经历这样一个令人兴奋的时刻，作为这项课题的全程亲历者，回顾整个研究过程中经历的点点滴滴和各个难关，心中难免感慨万千！说起Shisa7 这个课题，要追溯到2016年早期，当时我和Wei Lu 博士进行最新文献的常规跟踪检索时注意到了一些关于Shisa家族蛋白有意思的现象。出于科研上的经历和洞察力，Wei发现Shisa7是个十分有趣的蛋白，它与其他同家族蛋白的功能看起来并不一致。这是个非常有意思的线索，值得进一步研究！得益于Wei的决断力和执行力，我们迅速开始了Shisa7初步质粒构建的准备，没多久我便和两名实习生一起着手构建了Shisa7的表达载体质粒。但由于我当时正忙于另外一项课题的最后冲刺阶段【8】，Shisa7课题之后就交给了当年刚加入实验室的Wenyan Han博士。我在之后参与其中突触蛋白共定位和细胞表面受体蛋白运输的免疫荧光实验工作。由于Wenyan对电生理膜片钳技术的浓厚兴趣，加上她之前的药理学教育背景和丰富的动物行为学分析经验，同时在Wei的有力指导和多个合作者的通力配合下，克服重重困难，使得Shisa7 这个课题能够稳打稳扎快速向前推进，最终得以在Science上正式发表。
同时Wei Lu 实验室目前课题丰富前沿，经费充足，实验室仪器设备先进完备，诚招相关专业博士后人员1-2名，具体信息请发送邮件至：luw4@mail.nih.gov 或前往实验室网站查询：https://sites.google.com/site/lulaboratorynih/position-1?authuser=0
http://science.sciencemag.org/content/366/6462/246
1. Jackson AC, Nicoll RA. The expanding social network of ionotropic glutamate receptors: TARPs and other transmembrane auxiliary subunits. Neurone, 2012, PMID: 21521608.
2. Yamasaki T, Hoyos-Ramirez E, Martenson JS, Morimota-Tomita M, Tomita S. GARLH family proteins stabilize GABAAreceptors at synapses. Neuron, 2017, PMID: 28279354.
3. Wu M, Tian HL, Liu X, Lai JHC, Du S, Xia J. Impairment of Inhibitory Synapse Formation and Motor Behavior in Mice Lacking the NL2 Binding Partner LHFPL4/GARLH4.Cell Rep, 2018, PMID:29742426.
4. Davenport EC, Pendolino V, Kontou G, McGee TP, Sheehan DF, López-Doménech G, Farrant M, Kittler JT. An Essential Role for the Tetraspanin LHFPL4 in the Cell-Type-Specific Targeting and Clustering of Synaptic GABAA Receptors. Cell Rep, 2017, PMID:28978485.
5. Ge Y, Kang Y, Cassidy RM, Moon KM, Lewis R, Wong ROL, Foster LJ, Craig AM. Clptm1 Limits Forward Trafficking of GABAA Receptors to Scale Inhibitory Synaptic Strength. Neuron, 2018, PMID: 29395912.
6. Farrow P, Khodosevich K, Sapir Y, Schulmann A, Aslam M, Stern-Bach Y, Monyer H, von Engelhardt J. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 2015, PMID:26623514.
7. Schmitz LJM, Klaassen RV, Ruiperez-Alonso M, Zamri AE, Stroeder J, Rao-Ruiz P, Lodder JC, van der Loo RJ, Mansvelder HD, Smit AB, Spijker S. The AMPA receptor-associated protein Shisa7 regulates hippocampal synaptic function and contextual memory. eLife. 2017, PMID:29199957.
8. Li J, Han W, Pelkey KA, Duan J, Mao X, Wang YX, Craig MT, Dong L, Petralia RS, McBain CJ, Lu W. Molecular Dissection of Neuroligin 2 and Slitrk3 Reveals an Essential Framework for GABAergic Synapse Development. Neuron. 2017, PMID: 29107521